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微生物菌种的冷冻干燥保藏技术规程

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  • 发布时间:2013-05-30
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1、 安瓿管准备
安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时,先用2%盐酸浸泡过夜,自来水冲洗干净后,用蒸馏水浸泡至pH中性,干燥后、贴上标签,标上菌号及时间,加入脱脂棉塞后,121℃下高压灭菌15-20分钟,备用。
2、  保护剂的选择和准备
保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时,应注意其浓度及pH值,以及灭菌方法。如血清,可用过滤灭菌;牛奶要先脱脂,用离心方法去除上层油脂,一般在100℃间歇煮沸2-3次,每次10-30分钟,备用。
3、  冻干样品的准备
在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期,进行纯度检查后(参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》(试行)),与保护剂混合均匀,分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010/ml为宜(以大肠杆菌为例,为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升,只需10毫升琼脂斜面两支)。采用较长的毛细滴管,直接滴入安瓿管底部,注意不要溅污上部管壁,每管分装量约0.1-0.2毫升,若是球形安瓿管,装量为半个球部。若是液体培养的微生物,应离心去除培养基,然后将培养物与保护剂混匀,再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短,最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。
4、  预冻
一般预冻2小时以上,温度达到-20℃到-35℃左右。
5、  冷冻干燥
采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。
将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内,开始冷冻干燥,时间一般为8-20小时。
终止干燥时间应根据下列情况判断:
——  安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状
——  真空度接近空载时的最高值
——  样品温度与管外温度接近
——  选用1-2支对照管,其水份与菌悬液同量,视为干燥完结
——  选用一个安瓿管,装1-2%氯化钴,如变深兰色,可视为干燥完结
冷冻干燥完毕后,取出样品安瓿管置于干燥器内,备用。
6、  真空封口及真空检验
将安瓿管颈部用强火焰拉细,然后采用真空泵抽真空,在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。
 熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。
7、  保藏
安瓿管应低温避光保藏。
8、  质量检查
冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查,如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。
 
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